行焚除，皆不准买卖藏读也”（《诏书盖玺颁行论》），仅保留《圣经》（改称《新旧约》）及太平天国自编典籍。科举考试以“上帝教”教义为题，如“天父七日造成天地山海论”，录取者不论出身，甚至有女性参与科考，傅善祥成为中国历史上唯一的女状元。
为巩固天京政权，太平天国在定都后立即发起两大军事行动：北伐与西征。
咸丰三年四月（1853年5月），林凤祥、李开芳率两万精锐北伐，目标直捣北京。这支军队一路北上，经安徽、河南、山西，攻入直隶，前锋一度抵达天津杨柳青，震动清廷。咸丰帝急调僧格林沁率蒙古骑兵围剿，北伐军因孤军深入、补给断绝，于咸丰五年（1855年）全军覆没。《清史稿·文宗本纪》载：“（咸丰五年）正月，僧格林沁破贼于连镇，擒林凤祥，磔之（分裂肢体的酷刑）。四月，破冯官屯，擒李开芳，诛之，北伐贼平。”北伐虽败，却牵制了清军主力，为西征创造了条件。
西征军由胡以晃、赖汉英统领，于咸丰三年五月（1853年6月）溯江而上，旨在夺取安庆、九江、武汉等战略要地，控制长江中游。至咸丰四年（1854年），西征军先后攻克安庆、九江，并重占武汉，势力扩展至湖南。但在湘潭遭遇曾国藩湘军的顽强抵抗，被迫退守九江。此后，石达开率军增援，于湖口大败湘军水师，“烧其战船百余艘，曾国藩仅以身免”（《湘军志》），西征局势得以扭转。至咸丰六年（1856年），太平天国已控制从武昌到镇江的长江沿线，形成“天京—安庆—九江—武汉”的战略防线。
与此同时，清廷为围困天京，在南京东郊孝陵卫设立“江南大营”，由向荣统领；在扬州设立“江北大营”，由琦善统领。两大营互为犄角，对天京构成南北夹击之势。太平军与清军在天京外围展开反复拉锯，至咸丰六年（1856年），杨秀清调石达开、秦日纲等部回援，先后击溃江北、江南大营，暂时解除了清军对天京的军事威胁。
天京定都标志着太平天国进入鼎盛时期，其控制区域涵盖苏、皖、赣、鄂等省，人口达数千万，形成与清廷对峙的“南北分治”局面。英国驻上海领事密迪乐曾访问天京，在报告中称：“城中秩序井然，居民对太平军多表顺从，市集虽不如往昔繁盛，然粮食供应尚可。”（《英国议会文书》）
然而，定都后的太平天国也开始暴露危机。领导层生活腐化，洪秀全的天王府“周围十余里，墙高数丈，内外两重，外曰太阳城，内曰金龙城”（《金陵省难纪略》），杨秀清出行仪仗多达数千人，与起义初期的“平等”口号相去甚远。等级制度日益森严，“王爵”分封泛滥，至后期竟达两千七百余人，加剧了内部矛盾。
更关键的是，宗教神权与世俗政权的交织，使决策机制陷入混乱。杨秀清多次借“天父下凡”压制洪秀全，如咸丰四年（1854年），杨秀清以“天父”名义怒斥洪秀全：“尔与兄弟打江山，杀妖魔，何故在家耽延，不以国事为念？”（《天父下凡诏书》）这种权力斗争最终引发咸丰六年（1856年）的天京事变：洪秀全密令韦昌辉、石达开回天京诛杀杨秀清，韦昌辉却趁机滥杀无辜，屠戮东王府上下两万余人；石达开斥责韦昌辉残暴，反遭猜忌，被迫率十万精锐出走，后于大渡河畔覆灭。经此一变，太平天国